植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物，该产物在 520nm 有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定。该反应具有较强的专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物，碱性氨基酸对这一反应有干扰，但加入人造沸石（ permutit ），在 PH 1~7 范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸，精氨酸等 2 —氨基的氨基酸）。
3 ．酸性茚三酮试剂：称取 2.5g 茚三酮，加入 60mL 冰醋酸和 40mL 6mol/L 磷酸，于 70 ℃ 加热溶解，冷却后储于棕色试剂瓶中， 4 ℃ 保存，两天内稳定。
4 ．脯氨酸标准母液：称取 10mg 脯氨酸溶于少量 80% 乙醇中，再用蒸馏水定容至 100mL, 成 100μg/L 母液。
测脯氨酸含量：
1 ．脯氨酸标准曲线制作：吸取脯氨酸标准母液 0, 0.5, 1.25, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0mL 分别放入 8 个 50mL 容量瓶中，分别加入蒸馏水定容至 50mL ，配成 0.0 ， 1.0 ， 2.5 ， 5.0 ， 10.0 ， 15.0 ， 20.0 ， 30.0μg/mL 的系列溶液。分别吸取上述各标准溶液 2mL ，冰醋酸 2mL ，茚三酮试剂 2mL ，加入到 10mL 带塞刻度试管中，塞上塞子，于沸水浴中加热 15 分钟，用分光光度计测定 520nm 的光密度值，以零浓度为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标制作标准曲线。
2. 测定样品的脯氨酸含量
（ 1 ）提取脯氨酸：分别称取胚轴，每种处理各取三份，每份 0.3g 。剪碎，加入适量 80% 乙醇，少量石英砂，于研钵中研磨成匀浆。匀浆液全部转移至 25mL 刻度试管中，用 80% 乙醇洗研钵，将洗液移入相应的刻度试管中，最后用 80% 乙醇定容至刻度，混匀， 80 ℃水浴中提取 20 分钟。
(2 ）除去干扰的氨基酸： 向提取液中加入约 0.4g 的人造沸石和 0.2g 活性碳，强烈振荡 5 分钟，过滤，滤液备用。
（ 3 ）脯氨酸含量的测定： 分别吸取上述提取液 2mL 于刻度试管中，再取一支刻度试管，加入 2mL 80% 乙醇作为参比，分别向上述各试管中加入 2mL 冰醋酸和 2mL 茚三酮试剂，沸水浴中加热 15 分钟，冷却后在分光光度计测 520nm 处各样品的光密度，从标准曲线上查出每毫升被测样品液中脯氨酸的含量。
样品中脯氨酸含量的计算 :
脯氨酸含量 (μg/g)=(c x v/a)/w 或
脯氨酸含量 (%)=[(c*v)/a]/w*10 6 ×100
其中， C ：由标准曲线上查得的脯氨酸微克数；
v ：提取液总体积（ mL ）
a ：测定液体积（ mL ）
w ：样品重（ g ）
本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/8b68373510661ed9ad51f34f.html
文档为doc格式