植物中SOD的分离提取及性质研究

发布时间：2012-07-09 09:40:27 来源：文档文库

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实验课程：生物化学综合试验

实验项目：植物中SOD的分离提取及性质研究

指导老师：袁怀波

实验日期：2012.6.24-6.30

开课实验室：生物基础实验室

教学班级：生物工程10-2班

一．实验目的

SOD广泛存在于生物界，是防御氧毒害的关键酶。SOD主要有CuZn-、Mn-、Fe-SOD三种类型同工酶，它们共同的生物学作用是专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损伤作用），具有抗衰老、抗辐射、抗癌等生理作用。在医药中，SOD可用于治疗辐射病、自身免疫性疾病、炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中，可防止皮肤衰老、抗炎、防晒等作用。植物中大蒜的SOD含量丰富，所以，本实验研究大蒜中SOD的性质，并确定SOD同工酶类型。

二．实验原理

（一）SOD的性质

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。

SOD金属蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。

它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn—SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn—SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe—SOD)。

SOD催化如本实验中SOD取自大蒜并且引用邻苯三酚自氧化方法测定其活力的方法。邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化释放出O2-· 生成带色的中间产物反应开始后反应液先变成黄棕色几分钟后变成绿色几小时后又变成黄色这是生成中间产物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段中间物的积累在滞留30-45S后与时间成线性关系一般时间维持在4min内中间物在420nm波长处有强烈的光吸收。当有SOD存在时由于他能催化O2-·与H+结合生成O2和H2O2,从而阻止了中间产物的积累因此通过计算即可求出SOD的活性。酶活力单位定义在25℃恒温条件下每毫升反应液中每分钟抑制邻苯三氛自氧化率达50%的酶量定义为一个酶活力单位。

三．材料与方法

1、试剂 PH7.8 0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液（参照附录1） 2、氯仿-无水乙醇混合液以3：5体积比混合 3、PH8.2 50mmol/l Tris-HCL 参照附录II www.docin.com 4、10mmol/l HCL ,SOD样液； 5、50mmol/l邻苯三氛称取邻苯三氛0.063g,用10mmol/lHCL溶液溶解定容至10ml,避光保存。 6、2.45×10-3mol/l氮蓝四唑 NBT : 称200mgNBT使其溶于去离子水中并定容至100ml 置棕色试剂瓶中避光4℃保存。由于NBT溶液用量较多且NBT价格贵每次使用后妥善保存可反复使用多次。当黄色NBT溶液颜色变浅或变绿并出现沉淀时则不能继续使用应重新配制。 7、3.6×10-2mol/l PH7.8磷酸钠缓冲溶液内含2 8×10 -2 mol/l四甲基乙二胺(TEMED)、2 8×10-5 mol/l核黄素在100ml3.6×10-2mol/l PH7.8磷酸钠缓冲溶液配制参考附录I 中含0.42mlTEMED及1.32mg核黄素。至棕色瓶中 4℃保存。 8、冷丙酮 30%双氧水 40%蔗糖溶液内含0.1%溴酚蓝 ,Tris,TEMED,Acr,Bis,核黄素。

2.实验仪器

移液管、离心机5000r/min,量筒、烧杯、研钵、玻璃棒、微量移液器、试管、分光光度计、1cm比色皿、恒温水浴槽、电泳槽、电泳仪、培养皿、4*108日光灯、容量瓶、烧杯、冰箱等

3.实验内容

（ 1）大蒜粗酶液的提取

①提取：称4g左右的大蒜至于研钵（事先冷藏）中，使细胞破碎，再加入5ml 0.05mol/l PH7.8的磷酸盐缓冲溶液（事先冷藏），继续淹没搅拌15min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后5000r/min,离心10min，弃去沉淀，得提取液。 ②取出杂蛋白：提取物加入2倍体积的氯仿-无水乙醇混合溶剂，搅拌15min，5000r/min离心10min,取出杂蛋白，得粗酶液。

③沉淀SOD：将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,使SOD凝聚，5000r/min离心10min，得SOD沉淀溶于2ml PH7.8的磷酸盐缓冲溶液中。 ④热击处理：把提抽原液注入已编号的试管然后将试管置入恒温水槽，温度设置为60℃ 热击20min. 高速离心去杂取上层清液。稀释5倍待用。（2）.SOD性质的研究邻苯三氛自氧化法测定SOD的酶活性：㈠邻苯三氛自氧化速率的测定取两支试管按表1加入25℃预热过的缓冲液，然后加入预热过的邻苯三氛（空白管用10mmol/l HCL代替邻苯三氛），迅速摇匀，立即倾入1cm比色皿中，在325nm波长处测定光吸收值每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化，得出每分钟的自氧化速率。（可增减邻苯三氛自的加入量以控制光吸收值）

㈡SOD样液活性的测定

样品管取代自氧化管（表2）。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三氛。其余步骤同邻苯三氛自氧化速率的测定。

酶活性的计算：

酶活性=((自氧化速率-样液速率)/自氧化速率)*(100%)/(50%)*反应液总体积*样液稀释倍数/样液体积根据上述SOD酶活性的测定方法测定在不同PH下、不同温度下、激活剂和抑制剂下求出酶活性。做出酶活性和不同PH曲线、酶活性与温度曲线、以及在抑制剂条件下酶活力的大小。 ①不同PH对酶活力的影响：首先按下表加入PH分别为7.1的25℃预热过的缓冲液，注意加入预热过的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入1cm比色皿中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。改变PH分别为7.7,8.2,8.6,9.0，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。

②不同温度对酶活力的影响: 首先取试管按下表加入0℃的缓冲液，然后加入相同温度下的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入1cm比色皿中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。改变温度分别为25℃,50℃,75℃,100℃。记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。

③抑制剂的影响：按下表25℃预热过的液体，最后加入预热过的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入1cm比色皿中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。与不加抑制剂的相比较得出结论。

（3）.PAGE定位染色法鉴定同工酶的类型

1.配胶

按配方在模具中灌注分离胶后，小心的在分离胶的表面加一层水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），封住胶面，以促使聚合并使凝胶表面垂直。凝胶在30-40℃放置约40分钟-1小时后，可以看到一个界面，表示凝胶聚合。吸水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），用浓缩胶缓冲液贮液淋洗凝胶，然后灌注浓缩胶。并插入与模具大小相同，与凝胶厚度相当的梳子。为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。然后让模具再静止放置在30-40℃，聚合约40分钟-1小时（注意在分离胶和浓缩胶聚合时，应用日光灯照射以促使凝胶凝聚） ⑵、加样按下表加入试剂，充分振荡，使醇液与变性剂均匀混合。（Mn-SOD的活性受氯仿—— 乙醇的影响，cu—zn—SOD和Fe-SOD这两种同工酶均对H2O2酶感，cu——sOD对KCN 酶感，Mn—SO D不受CN的影响）

待各管溶液配置好后，分别取10ul加入凝胶的3个齿上。

⑶、电泳 SOD同工酶的分离采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳。连接电源，调节电流至15mA,带样品由浓缩胶进入分离胶时，再将电流调至20-30mA，当染料前言距离凝胶边缘1-2cm时，关闭电源，电泳结束。 ⑷、染色 SOD活性染色取凝胶板，采用SOD负染色方法，按以下次序浸泡于培养皿中染色 (1)在2·45×10 – 3mol/l氮蓝四唑(NBT)黑暗下浸泡20分钟; (2)在3.6×10-2mol/l PH7.8磷酸钠缓冲溶液（内含2·8×10 -2 mol/l四甲基乙二胺(TEMED)、2·8×10-5 mol/l核黄素）中，在黑暗条件下浸泡15min. (3)5×10-2mol/L pH7.8磷酸钠缓冲溶液。凝胶板移入此浸泡液，在4×108W日光灯下光照射20~30min. 经上述染色和光照后的凝胶板，在蓝色背景上出现清晰的透明的SOD活性染色带。染色后的胶板用水漂洗数次后，比较观察凝胶板条带，分析得出结论。

4．实验数据处理

邻苯三酚自氧化速率的测定

A/t	0min	0.5min	1min	1.5min	2min	2.5min	3min	3.5min	4min
空白管	0.008	0.003	0.009	0.013	0.013	0.08	0.013	0.03	0.013
自氧化管	0.414	0.424	0.427	0.422	0.431	0.437	0.420	0.430	0.455