菌种保藏
一、菌种的含义：
菌种：菌种是指食用菌、工业菌、农用菌菌丝及其生长基质组成的繁殖材料。分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级，也可以理解为保存着的、具有活性的菌株。
微生物工业对菌种的要求
1.原料廉价，生长迅速、目标产物高。
2.易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短。
3.抗杂菌和噬菌体的能力强。
4.菌种遗传性能稳定，不易变化和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。
5.对放大设备的适应强。
二、菌种保藏的重要意义：
菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产，如抗生素、氨基酸、酿造等工业，都离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。
其任务首先是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来，而不致向坏的方面转化。
菌种是一种极其重要和珍贵的生物资源，1980年我国成立了中国微生物菌种保藏委员会。
菌种保藏的原理与方法
微生物菌种保藏的概念：收集实验室和生产用微生物（菌种、菌株、病毒毒株等，也包括动、植物的细胞株和微生物质粒），运用适当方法和措施使其长期存活并保持原种的生物学性状稳定不变，使之不死、不衰、不乱，以达到便于研究、交换和使用等目的的措施。
微生物个体微小、代谢活跃、生长繁殖快，很容易发生变异，或被其他微生物污染，甚至死亡。因此根据实际情况选择合适的保藏方法十分重要。
一、菌种保藏的原理：
菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创条件使其生长代谢处于最低或几乎停止的状态，以减少其变异和保持生物性状。
保藏时，一般利用菌种的休眠体（孢子、芽孢等），创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，以降低菌种的代谢活动，减少菌种变异，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力，达到长期保存的目的。
一个好的菌种保藏方法，应能保持原菌种的优良特性和较高的存活率，同时也应考虑到方法本身的经济、简便。
国内外主要菌种保藏机构介绍
国外
（1）ATCC 美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市.
（2）CSH 冷泉港研究室，美国.
（3） IFO 日本大阪发酵研究所，日本大阪.
（4）NRRL 美国北部地区研究实验会
（5）CBS 荷兰霉菌中心保藏所
（6）ＮCTC 英国国家典型菌种保藏所
现有菌种保藏的大体方法有
1.传代培养法
2.悬液法
3.载体法
4.真空干燥法
5.冷冻法
菌种保藏的注意事项
（1）菌种保藏所处的状态大部分以均保藏其休眠体，保藏前选择合适的培养时间。培养时间过长，生产性能会下降，反之保存时容易死亡。一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟保藏的菌种进行保藏，效果较好。
（2）保藏所用的基质一般使其营养成份贫乏较好，降低其代谢活动。冷冻时应加入保护剂。
（3）操作过程尽量减少对细胞结构的损害，如选择合适的冻结速度，加入保护剂等。细胞结构的损伤不仅使菌种保藏的死亡率增加，而且容易导致菌种变异，造成菌种性能衰退。
二、实验室和生产实践中常用的菌种保藏技术方法：
1. 斜面低温保藏法（冰箱保藏法）
2．矿物油中浸没保藏法
3．穿刺法
4. 滤纸法
5. 固体曲保藏法
6．砂土管保藏法
7. 普通冷冻保藏
8．超低温冷冻保藏法
9. 冷冻干燥法
10. 液氮冷冻保藏法
11. 寄主保藏
保藏方法通常基于温度、水分、通气、营养成分和渗透压等方面考虑
1.斜面低温保藏（冰箱保藏法）
原理是利用低温（4℃）降低菌种的新陈代谢，使菌种的特性在短时期内保持不变。
方法是：将菌种转接在适宜的固体培养基斜面上，待其充分生长好后，用封口膜或油纸将棉塞部分包扎好，置于4℃冰箱中保存。
斜面法保藏菌种的时间依微生物的种类不同而异。霉菌、放线菌以及形成芽孢的细菌保存3~5个月移种一次，普通细菌最好每月移种一次，假单胞菌则两周传代一次，酵母菌间隔2个月。
注意事项
1.保存期间要注意冰箱的温度，不可波动太大，不能在0℃以下保存，否则培养基会结冰脱水，造成菌种性能衰退或死亡。
2.此方法是一种短期、过渡的保藏方法此方法，一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。
优缺点
优点:最为简单和经济，操作简单、使用方便、不需要特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异、与污染杂菌等。可用于实验室中若干菌种的保藏。
缺点:保藏时间短、需定期传代，且易被污染，菌种的主要特性容易改变。易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变
2. 矿物油中浸没保藏（石蜡油封藏法）
1.先将液体石蜡分装于试管或三角瓶中，塞上棉塞并用牛皮纸包扎，121℃灭菌30min，然后放在40温箱中使水汽蒸发后备用。
2.将需要保藏的菌种在最适易的斜面培养基中培养，直到菌体健壮或孢子成熟。
3.用无菌吸管取适量的无菌液体石蜡，加在已长好的菌苔的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。
4.将试管直立，置于低温或室温下保存（有的微生物在室温下比在冰箱中保存的时间要长）。
此法实用效果较好。产孢子的霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏2年以上，有些酵母菌可保藏1~2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保存3个月之久。
注意事项
1.以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株2～3年也应做一次存活试验。
2.从液体石蜡下面取培养物移种后接种环在火焰上灼烧时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意，尤其是保藏致病菌更需小心。
优缺点：
优点：制作简单，不需特殊装备，且不需经常移种。
缺点：保存时必须直立放置，所占位置较大；同时也不便携带。
3. 穿刺法
该方法比较简便，是短期保藏菌种的一种有效方法。
1.接种培养（培养试管选用带螺旋帽的短试管或离心管）。
2.将培养好的穿刺管盖紧，外面用封口膜封严，置于于4℃存放。
3.取用时将接种环（环的直径尽量小些）伸入菌种生长处挑取少许细胞，接入适当培养基中。将穿刺管封严后可保存以后再用。
4.滤纸法
1、滤纸的制备
将滤纸剪成0.5cm×1.2cm的小纸条装入0.6cm×8cm的安瓿管中，每管装入1~2片，用棉花塞上后经121℃灭菌30min。
2、保护剂的制备
配制20％脱脂奶，装在三角瓶或试管中112℃灭菌25min。待冷却后随机取出几份分别置28℃、37℃培养过夜，然后各取0.2mL涂布在肉汤平板上或斜面上进行无菌检查，确认无菌后方可使用，其余的保护剂置4℃存放待用。
3、菌种培养
将需保藏的菌种在适宜的斜面培养基上培养，直到其生长丰满。
4、菌悬液的制备
取无菌脱脂奶2~3mL加入待保存的菌种斜面试管内，用接种环轻轻地将菌苔刮下，经振荡器震荡均匀，即为菌悬液。
5、分装样品：用无菌滴管或吸管吸取菌悬液滴在安瓿瓶中的滤纸上，每片滤纸滴0.5mL，塞上棉花。
6、干燥：将安瓿管中放入五氧化二磷或无水氯化钙作吸水剂的干燥瓶中，用真空泵抽其至干。
7、熔封与保存：用火焰将安瓿管封口，置于4℃或室温存放。
8、需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。
细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14—17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。
5. 固体曲保藏法
这是根据我国传统制曲原理加以改进的一种方法，适用于产孢子的真菌。该法采用麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为产孢子培养基，使菌种产生大量的休眠体（孢子）后加以保存。该法的要点是控制适当的水分。
6.砂土管保藏法
本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。适用于产孢子的放线菌、霉菌以及产芽孢的细菌。砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般为3：2或1：1。
（1）取河沙加入10％稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。倒去酸水，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸馏水冲洗。烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。
（2）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。
（3）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10mm×100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2~3次），烘干。
（4）抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。
（5）选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，加入2~3mL无菌水，用接种环轻轻地将菌苔洗下，制成孢子悬液。
（6）于每支沙土管中加入约0．5ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。
（7）放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分。每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。若经检查没有问题，用火焰熔封管口（也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口），放冰箱（4℃）或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。
（8）需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。
此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但对于营养细胞效果不佳。
7.普通冷冻保藏
由于该法的保藏温度为－20℃，为了避免微生物受损伤致死，需要甘油作为保护剂。甘油的最终浓度为25%。
具体操作如下：
①配制浓度为50％的甘油溶液，121℃ 灭菌后备用；
②制备菌悬液，一般菌悬液的浓度为108～1010个／mL；
③将菌悬液和甘油溶液以等体积混合均匀后，置－20℃保藏。 或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。
普通冷冻保藏可以维持若干微生物的活力1~2年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。
这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。
8. 超低温冷冻保藏
要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60～-80℃以下进行保藏。
在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：
1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞
2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；
3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；
4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。
如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。
9．冷冻干燥法
其基本原理是在较低的温度下（－18℃），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异或死亡，因而能长期保存，一般为5～10年。此法适用于各种微生物。
具体的做法是先将微生物制成悬浮液，与保护剂（一般为蔗糖、脱脂牛奶或血清等）混合，放在安瓿管内，用低温酒精或干冰（－15℃以下）使之速冻，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，低冻温保存备用。
冷冻干燥后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。
（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管，大小要求外径6—7．5mm，长105mm，球部直径9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，备用。
（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24—48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7—10天。
（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0．2ml。
（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。
（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。
抽气一般若在30分钟内能达到93．3Pa（0．7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），保持压力6—8小时即可。
（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约10分钟即可达到26．7Pa（0．2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。
此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。
冻干菌种的保藏与再生
1．保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好。
2．复苏：
在安瓿中加入0.5～1ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。
在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l～2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5～l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。
10. 液氮冷冻保藏法
液氮超低温保藏法是近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。
原理：用液氮能长期保存菌种，这是因为液氮的温度可达－196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（－130℃），所以此时菌种的代谢活动已基本停止，化学作用亦随之消失。
保藏方法
1.冷冻管的制备：液氮保藏用的冷冻管要求既能经121℃高温灭菌又能在-196℃低温长期存放。冷冻管一般容量为两毫升。用自来水洗净后经蒸馏水冲洗多次，烘干，121℃灭菌30min.
2.保护剂：配制10％~20％的甘油，121℃灭菌30min。使用前随机进行无菌检查。
3.菌悬液制备：取新鲜的培养健壮的斜面菌种加入2~3mL保护剂，用接种环将菌苔洗下震荡，制成菌悬液。
4.样品分装：有不易褪色的记号笔在冷冻管上注明菌种编号，用无菌吸管吸取菌悬液，加入冷冻管中，每只管加入0.5mL菌悬液，拧紧螺旋帽。
5.欲冻处理：设定降温程序，室温~0℃,5℃/min; 0℃~-40℃,-1℃/min; -40℃~-70℃,
-5℃/min,再转入液氮管吊桶内，作好记录。不具备程控降温可以利用冰箱实现逐级降温。先将冷冻管置4℃冰箱中放30min后转入冰箱上格-18℃处放置20~30min，再置-30℃低温冰箱或冷柜20min后，快速转入-70℃超低温冰箱。也可以使用干冰、盐冰等方法降温。
6.保存：经-70℃1h冷冻，将冷冻管快速转入液氮罐液相中，并记录菌种、位置、管数、存放日期以及操作者。
7.解冻：需使用样品时，戴上棉手套从液氮罐中取出冷冻瓶，用镊子迅速放入37℃水浴锅中摇动1~2min，样品很快融化。然后在超净台上用无菌吸管取出菌悬液加入适宜的培养基中恒温培养。
11. 寄主保藏 适用于一些难于用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。
核酸的保藏
DNA和RNA常采用的保存方法
1、以溶液形式置低温保存：DNA溶于无菌TE缓冲液（10mmol/L Tris·Cl ，1mmol/L EDTA，pH 8.0）中，其中EDTA的作用是螯合溶液中二价金属离子，从而抑制DNA酶的活性（Mg2+是DNA酶的激活剂）。pH调至8.0是为了减少DNA的脱氢反应。哺乳动物细胞DNA样品中加入1滴氯仿，避免细菌和核酸的污染。
RNA一般溶于无菌0.3mol/L醋酸钠（pH5.2）或无菌双蒸馏水中，也可在RNA溶液中加1滴0.3mol/LVRC（氯钒核糖核苷复合物），其作用是抑制RNase的降解。核酸分子溶于合适的溶液后可置4℃、-20℃或-70℃条件下存放。4℃条件下可保存6个月左右，-70℃条件下则可存放5年以上。
2、以沉淀的形式置低温保存：乙醇是核酸分子有效的沉淀剂。将提纯的 DNA或RNA样品加入乙醇使之沉淀，离心后去上清液，再加入乙醇，置4℃、-20℃可存放数年，而且还可以在常温状态下邮寄。
3、以干燥的形式保存：将核酸溶液按一定的量分装于离心管中，置低温（盐冰、干冰、低温冰箱均可）预冻，然后在低温状态下进行真空干燥，置4℃可存放数年以上。取用时置需加入适量的无菌双蒸馏水，待DNA或RNA溶解后便可使用。
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